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Notas Técnicas


Ilustración esquemática de la tomografía y el proceso de reconstrucción. El objeto 3D se proyecta en el (S)TEM logando imágenes que pueden ser recombinadas usando la técnica de proyección posterior (transformada inversa de Radon)


Render 3D de vesículas criohidratadas cubiertas de proteínas virales tras el proceso tomográfico a 300kV.


Render 3D de una muestra catalítica adquirida en STEM modo HAADF.


Render 3D del cilio de un paciente enfermo después de la tomografía SerialEM en un JEM-1400 mostrando los brazos de dineína deconectados.

Tomografía Crioelectrónica por TEM

La tomografía es una técnica que emplea una serie de imágenes registradas sucesivamente a partir de un objeto en diferentes ángulos de inclinación con respecto al haz de electrones con el fin de obtener la estructura tridimensional de dicho objeto utilizando una técnica de proyección posterior. Las imágenes pueden ser obtenidas en un microscopio electrónico de transmisión (TEM) o en un microscopio electrónico de transmisión con barrido (STEM).  JEOL ha adoptado el software SerialEM de laboratorio de Boulder para microscopía electrónica 3D de las células BL3DE, para hacer de la tomografía una técnica accesible, eficiente y fácil para todos los aspectos de la investigación científica, industrial y médica.

La modalidad de la toma de imágenes depende principalmente del objeto que se está estudiando. Por ejemplo, las estructuras que muestran fuertes efectos de difracción, muy comunes en Materiales, tienden a ser estudiados con mayor eficacia en el modo STEM utilizando imágenes obtenidas en un detector anular de ángulo alto (HAADF). Por el contrario, las muestras en Ciencias de la Vida, que se caracteriza por la abundancia de elementos de bajo número atómico Z y por lo tanto bastante desprovistas de efectos de difracción. Éstas tienden a ser estudiadas en su mayoría mediante TEM de campo claro. El software SerialEM se puede aplicar a todos los TEM en la línea de JEOL - proporcionando de esta manera una solución para todos los aspectos de la microscopía enfocada a estructuras 3D.

 

La tomografía es aplicable a una amplia variedad de muestras, desde lif-outs FIB resistentes al haz hasta especímenes hidratados congelados. Una opción de “baja dosis” en el SerialEM permite tomar imágenes de especímenes en su estado natural, es decir, después de la vitrificación. Toda la serie tomográfica puede obtenerse sin dañar visiblemente la muestra. La elección de JEOL USA  para tomografía incluye el procesamiento usando IMOD (también disponible en la BL3DEMC).

La opción de “baja dosis” también permite el uso de magnificación extremadamente alta para la  formación de imágenes, como es el caso por ejemplo del modo de STEM. La capacidad de realizar pasos críticos en la tomografía, tales como el seguimiento, el enfoque y la grabación de la imagen final, con diferentes magnificaciones, asegura al  operador que el objeto de interés permanece en la cámara fotográfica (o el detector de electrones en STEM) bajo todas las condiciones a medida que se inclina la muestra.

La Tomografía ahora también se está aplicando en el campo del diagnóstico por imagen, por ejemplo, en discinesia ciliar primaria (Brink and Carson, MSA Proc.(2010) 16:970)
En la figura se muestra en una sección transversal del cilio que se ha obtenido después de aplicar imágenes en 3D mediante tomografía. La reconstrucción se hace girar de manera de lograr vistas que son idénticas a perfectas secciones transversales axiales a través del cilio. Nótese los dobletes de microtúbulos en esta vista que indican la orientación correcta de los cilios. Un flujo de trabajo fiable por lo tanto, puede afirmarse que da respuestas rápidas ya que esta reconstrucción se puede obtener en unos 30 minutos. Por último, SerialEM tiene la capacidad de capturar montajes a gran escala como se ejemplifica en la obra del laboratorio Marc en U. de Utah
Montajes como estos están al alcance de los investigadores a través de una interfaz de usuarios robusta y fácil de configurar en serialEM. El montaje puede hacer uso de cualquiera de las dos técnicas de desplazamiento, ya sea moviendo la platina o deflactando el haz de electrones.

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